ELISA免疫標(biāo)記技術(shù)實(shí)驗(yàn)原理

免疫標(biāo)記技術(shù)是將一些既易測(cè)定又具有高度敏感性的物質(zhì)標(biāo)記到特異性抗原或抗體分子上，通過(guò)這些標(biāo)記物的增強(qiáng)放大效應(yīng)來(lái)顯示反應(yīng)系統(tǒng)中抗原或抗體的性質(zhì)與含量。常用的標(biāo)記物包括熒光素、酶和放射性核素等，用這3種標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記的免疫檢測(cè)技術(shù)被稱(chēng)為3大免疫標(biāo)記技術(shù)。目前，使用的免疫標(biāo)記物還有化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、鐵蛋白和膠體金等。

1.原理

辣根過(guò)氧化物酶(HorserADIsh Peroxidase, HRP)

辣根過(guò)氧化物酶 (horse radish peroxidase，簡(jiǎn)稱(chēng)HRP，EC.1.11.1.7)是植物中研究得zui深入的一種過(guò)氧化物酶，早在20世紀(jì)30年代就有人著手從辣根中分離此酶，以后又制備出結(jié)晶。本實(shí)驗(yàn)是以辣根為原料，經(jīng)過(guò)水的抽提，硫酸銨和丙酮分級(jí)分離，再經(jīng)鋅離子純化，透析除鹽，冰凍干燥，便可得到高純度的辣根過(guò)氧化物酶。

辣根過(guò)氧化物酶是一種含亞鐵血紅素的蛋白質(zhì)，HRP廣泛分布于植物界，它是由無(wú)色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結(jié)合而成的糖蛋白，糖含量18%。HRP由多個(gè)同功酶組成，Mr在40000左右，等電點(diǎn)7.2。溶于水，溶解度為5%(W/V)，溶液呈棕紅色，透明。酶催化的zui適PH因供氫體不同而稍有差異，但多在pH5左右。酶溶于水和58%以下的硫酸銨溶液。HRP可溶于0.58飽和度以下的硫酸銨溶液，而0.62飽和度以上則不溶。該酶zui適pH7.0(對(duì)愈創(chuàng)木酚為氫給體而言)。在室溫下，HRP幾周內(nèi)穩(wěn)定，加熱到63℃，在15min內(nèi)穩(wěn)定。氧化還原電勢(shì)很低，pH6.08時(shí)，E 0 =-0.2070V，pH為7.71時(shí)，E′0 =-0.2787V。HRP的輔基和酶蛋白zui大吸收光譜分別為403nm和275nm，一般以O(shè)D403nm/OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的純度。* ?# p. n2 ~1 w. X3 b

酶標(biāo)記物包括酶標(biāo)記抗原、酶標(biāo)記抗體和酶標(biāo)記SPA等。酶標(biāo)記物質(zhì)量的好壞直接關(guān)系到免疫酶技術(shù)的成功與否，因此被稱(chēng)為關(guān)鍵的試劑。酶標(biāo)記物中zui常用的是酶標(biāo)記抗體，它是將酶與特異性抗體經(jīng)適當(dāng)方法連接而成。酶標(biāo)記抗體的質(zhì)量主要取決于純度好、活性強(qiáng)及親和力高的酶和抗體，其次要有良好的制備方法。目前，高質(zhì)量的酶(如辣根過(guò)氧化物酶，簡(jiǎn)稱(chēng)HRP)國(guó)內(nèi)已有商品供應(yīng)。高質(zhì)量的抗體則可通過(guò)提取純化而獲得。在制備方法上，宜選用產(chǎn)率高、不影響結(jié)合物的活性和不混雜干擾性物質(zhì)且操作簡(jiǎn)便易行的方法。